Техника Вестерн-блот и её применение в диагностике14.10.2010

В предыдущей статье, посвященной технике Вестерн-блот, мы сосредоточили внимание на технике раскрывания белков, называемой ELISA. Продолжая тему исследований, основанных на использовании антител, в данном номере мы обратим внимание на следующую очень важную диагностическую технику - Вестерн-блот (реже называемую иммуноблотингом).

Вышеприведённые определения обозначают метод детектирования конкретных белков в клеточном гомогенате или белковом экстракте, посредством их электрофорного разделения, остановления на мембране и использования соответствующих антител. Название Вестерн-блот (анг. "western" - западный) возникло как своеобразная игра слов, по отношению к названию техники - Саузерн-блот (Southern blot). Хотя название выводится от фамилии её творца (Саузерн (анг. Southern) - обозначает южный), то следующие техники, использующие трансфер биополимеров на мембрану, названы, посредством добавления к слову "блот" (анг. пятно, пачкать, мазать) описания других сторон мира [1, 2].

Первым этапом процедуры является освобождение клеточных белков из препарата. С этой целью применяются механические методы, как напр. гомогенизация в ступке, соответствующем гомогенизаторе или мельнице и соответствующие буферы, содержащие детергент (напр. Triton X100 или SDS), а также некоторые вещества (напр. EDTA)[2, 3, 4]. Иногда, вместо всех клеточных белков, анализируются исключительно белки, полученные из оболочек или избранных органелльных фракций. С данной целью осуществляется соответствующие процедуры их изоляции. Полученные, таким образом, хомогенаты или белковые экстракты разделяются методом электрофореза на полиакриламид-геле (обычно в условиях денатурирующих в геле, совмещающим SDS)[3, 4]. Благодаря этому, мы получаем раздел всех белков экстракта на основании их молекулярной массы. Следующий этап - их трансфер на соответствующую мембрану, изготовленную из нитро-целлюлоза или PVDF (поливинилиденфторида) [2, 3]. Иногда применяется так наз. капиллярный трансфер, заключающийся в размещении мембраны между гелем и кучей фрагментов бумажки, которые засосают жидкость из геля и, вместе с ним, белки. Альтернативный метод определяется термином электротрансфера и использует электрическое поле, с целью перенести разделенные белки на мембрану. Качество трансфера можно проверить, обозначая мембрану красителем Ponceau S или Coomasie. Следующий шаг - блокирование, т.е. защита мембраны от неособого вязания к ней антител. Этот эффект получается, благодаря инкубации в растворе альбумина из говяжей сыворотки или обезжиренного молока и детергента Tween [2, 3]. После окончания блокирования можно приступить к инкубации мембраны в растворе антител. Обычно применяются два антитела. Первое антитело (так наз. первичное) специфически вяжется к нужному белку. Его избыток следует удалить посредством отмытия, с помощью соответствующего буфера. Затем применяется раствор второго антитела, называемого второстепенным (иногда раньше происходит вторичное блокирование неспецифических мест, вяжущих на мембране). Оно связывается с первичным антителом и обозначается, что позволяет его детектировать (следует отметить, однако, что возможно также обозначить и детектировать первичное антитело, хотя данный вариант применяется реже). В качестве обозначающего элемента обычно выступает энзим (после добавления соответствующего субстрата), катализирующий реакцию, вследствие которой получается эффект химилюминесценции или цветной реакции. Антитело можно также обозначить радиоактивно или с помощью флюоресценционного красителя. В случае реакций химилюминесценций и обозначения радиоактивными изотопами, результат процедуры можно заметить на соответствующем клише. Если проба обозначается энзимом, вызывающим цветной эффект, тогда данный результат отражается непосредственно на мембране; в свою очередь, результат, получен вследствие употребления флюорохрома, можно наблюдать при помощи соответствующего сенсора (напр. камеры CCD)[2, 3]. Следует отметить также, что часто выполняется вариант этой техники, в котором исследуется не только находится ли данный белок в определённом материале, но находятся ли в исследуемой сыворотке антитела, направленные против антигенов, связанных напр. с  искаемым нами  „микробомом” (антитела из исследуемой сыворотки рассматриваются здесь, как эквивалент первичных антител).

Так в науке, как и медицине метод Вестерн-блот быстро нашёл многочисленные применения. Иммуноблотинг применяется в диагностике бактерийных болезней, как Лайм-боррелиоз, вызываемый спирохетом Borelia burgdorferi, туберкулёз, вызываемый Mycobacterium tuberculosis. [5, 6, 7]. Данную технику можно также использовать в диагностике заражений и инфекций вирусами, как напр. ВИЧ, коронавирус, вызывающий САРС или вирус ВПГ (HSV), являющийся этиологическим фактором сыпи [8, 9, 10, 11]. С помощью метода Вестерн-блот можно также раскрыть некоторые паразитические болезни, как финноз, вызванная личинками вооружённого солитёра, а также генетические болезни, как напр. некоторые формы анемии Фанкони [12, 13 анемия]. В свете новейших знаний следует отметить, что возможным является также применение данной техники в диагностике новообразований, что свидетельствует о необычайной полезности и всесторонних возможностях её использования [14].

Библиография:

1. Nick; Bitesize Bio: brain food for cell and molecular biologists: Southern, northern, western (and eastern?); http://bitesizebio.com/2008/07/09/southern-northern-western-and-eastern/;  02.09.2009
2. Wikipedia, the free encyclopedia: Western blot; http://en.wikipedia.org/wiki/Western_blot; 02.09.2009 
3. Western blot protocols, troubleshooting, scientific resources and research articles for the research community and science students; www.westernblotting.org; 31.08.2009
4. UC Davis – University  of California Department of Microbiology; micro.mic.ucdavis.edu/; 02.09.2009
5. Zöller L, Cremer J, Faulde M; Western blot as a tool in the diagnosis of Lyme borreliosis; Electrophoresis; 09.1993
6. Sławomir Czernecki; Borelioza - choroba kontrowersyjna. Zarys problemu; IGM Internetowa Gazeta Medyczna; 01.2009
7. Rovatti E, Corradi MP, Amicosante M, Tartoni PL, Panini W, Ancora A, Cenci AM, Zucchi L, Monno L, Angarano G, Saltini C; Evaluation of a western blot serum test for the diagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection; European Respiratory Journal; 02.1996
8. Chan EL, Sidaway F, Horsman GB; A comparison of the Genie and western blot assays in confirmatory testing for HIV-1 antibody; Journal of Medical Microbiology; 03.1996
9. Sudha T, Lakshmi V, Teja VD; Western blot profile in HIV infection; Indian Journal of Dermatology, Venereology and Leprology; 9-10.2006
10. He Q, Chong KH, Chng (sprawdź to nazwisko, bo chyba pominąłes jakąś litere) HH, Leung B, Ling AE, Wei T, Chan SW, Ooi EE, Kwang J; Development of a Western blot assay for detection of antibodies against coronavirus causing severe acute respiratory syndrome; Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology; 03.2004
11. Martins TB, Woolstenhulme RD, Jaskowski TD, Hill HR, Litwin CM; Comparison of four enzyme immunoassays with a western blot assay for the determination of type-specific antibodies to herpes simplex virus; American Journal of Clinical Pathology; 02.2001
12. Villota GE, Gomez DI, Volcy M, Franco AF, Cardona EA, Isaza R, Sanzón F, Teale JM, Restrepo BI; Similar diagnostic performance for neurocysticercosis of three glycoprotein preparations from Taenia solium metacestodes; The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene; 03.2003
13. Pilonetto DV, Pereira NF, Bitencourt MA, Magdalena NI, Vieira ER, Veiga LB, Cavalli IJ, Ribeiro RC, Pasquini R; FANCD2 Western blot as a diagnostic tool for Brazilian patients with Fanconi anemia; Brazilian Journal of Medical and Biological Research; 03.2009
14. Streckfus C, Bigler L; The use of soluble, salivary c-erbB-2 for the detection and post-operative follow-up of breast cancer in women: the results of a five-year translational research study; Advances in Dental Research; 06.2005